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Colloque
La purification d'un transporteur membranaire fonctionnel implique le choix de conditions physico-chimiques compatibles avec le maintien de son activité biologique lors de chacune des étapes de solubilisation, de chromatographie et de reconstitution. Le transporteur responsable de la réabsorption rénale du phosphate s'est avéré particulièrement sensible à la composition des tampons d'extraction. Celui-ci coïncide avec les lipides extraits de la membrane rénale et ne peut être réactivé en absence de l'association du peu des lipides extraits du duodénum. Le milieu d'extraction doit contenir une faible concentration de sodium pour permettre l'extraction de l'eau de la solution. Le glycérol peut cependant être …
Colloque
La réabsorption du phosphate est effectuée par un co-transporteur dont l'activité est fortement inhibée par les agents modificateurs spécifiques des résidus d'arginine. La réaction de ces composés avec le transporteur de phosphate a été étudiée dans le but de déterminer le nombre, la localisation et le rôle des arginines sensibles à la modification chimique. L'inactivation du transporteur par le phénylglyoxyl augmente avec l'alcalinité du milieu réactionnel et atteint un maximum à pH 9,0. L'effet du pH est très prononcé dans le milieu intravésiculaire, mais essentiellement nul dans le milieu extravésiculaire. L'inactivation de l'influx de phosphate par le p-hydroxyphénylglyoxal, un réactif …
Colloque
Dans le but de purifier et d'identifier la protéine transportrice responsable de la réabsorption rénale du phosphate, nous avons mis au point un protocole de reconstitution qui permet de mesurer son activité après chaque étape de la purification. Le transporteur reconstitué à partir du rein de bœuf possède les principales caractéristiques du transporteur natif dont une affinité semblable (40 μM) pour le phosphate. La captation de phosphate par les protéoliposomes est fortement stimulée (2000-300%) par la présence d'un gradient transmembranaire de sodium. La taille moléculaire du transporteur a été évaluée avec la technique d'inactivation par irradiation. Le transporteur bovin possède …
Colloque
Le phosphate est réabsorbé par un transporteur spécifique qui utilise l'énergie du gradient de sodium. Dans le but de purifier et d'identifier la protéine responsable de ce transport, nous avons mis au point un système de reconstitution qui permet de mesurer son activité après solubilisation de la membrane. Le transporteur s'est avéré particulièrement sensible aux conditions de solubilisation. Pour préserver son activité, des membranes luminales purifiées ont été solubilisées avec du CHAPS, en présence de glycérol, de lipides, de détergent, de sodium et de phosphate. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide montre que des protéines séparées avec de tels extraits protéiques …
