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Colloque
La caractérisation du site de liaison d'une protéine sur le RNA ribosomique peut préciser quels sont les signaux qui contrôlent la spécificité de cette interaction RNA - protéine. Nous avons examiné l'interaction de la protéine S7 avec le RNA 16S du ribosome d'E. coli. On sait que cette protéine interagit avec le domaine 3 du RNA 16S. Différents plasmides ont été construits, à partir desquels nous pouvons obtenir par transcription in vitro soit le domaine 3 complet (positions 926 à 1393), soit divers fragments de ce domaine. Nous avons ensuite examiné, par la technique de filtration sur membranes de nitrocellulose, …
Colloque
Des délétions (de 5 à 16 nucléotides) ou des substitutions ont été introduites dans la région 5' terminale du gène du RNA 16S d'E. coli, dans l'opéron rrnB du plasmide pKK3535 ou dans le phagemide pDL4417 (où il est sous contrôle d'un promoteur T7). Les ribosomes ont été extraits de bactéries transformées avec les mutants dérivés de pKK3535 et leur activité de synthèse a été évaluée par une batterie d'essais (synthèse sous la direction de messagers artificiels ou naturels, réponse à des agents qui induisent des erreurs de lecture...). Le RNA 16S a aussi été extrait à partir de mutants …
Colloque
Le RNA 16S de la sous-unité 30S du ribosome bactérien est divisé en 4 domaines principaux. À partir d'un plasmide contenant le gène du RNA 16S d'E. coli sous contrôle d'un promoteur T7, nous avons construit des plasmides permettant la transcription in vitro des domaines 1 et 2, le domaine 3 et les domaines 3 et 4 du RNA 16S. Ces domaines isolés doivent globalement conserver leur structure native. Le RNA 16S peut interagir avec la sous-unité 50S in vivo. Les domaines "mini-sous-unités" 30S, isolés à partir de mutants de protéines absentes de la sous-unité 30S (S4, S6, S8, S15, …
Colloque
Le RNA 16S de la sous-unité ribosomique 30S d'E. coli est subdivisé en 3 principaux domaines structuraux. À partir d'un plasmide contenant le gène du RNA 16S, nous avons construit un dérivé, pFD34, qui contient une portion du gène du RNA 16S, depuis le début du domaine 3 jusqu'à l'extrémité du gène, directement en aval d'un promoteur T7. La transcription in vitro de ce plasmide linéarisé au site RsaI produit le domaine 3 du RNA 16S. Des études avec diverses sondes chimiques indiquent que ce fragment adopte une conformation semblable à celle qu'il possède à l'intérieur du RNA 16S. Lorsqu'il …
Colloque
Nous avons montré précédemment que la streptomycine (Sm) se lie au RNA 16S de la sous-unité ribosomique 30S d'E. coli, dans la région des bases 892 à 917. Nous avons introduit des délétions dans cette région en utilisant un plasmide construit dans notre laboratoire, pPM112, qui contient le gène codant pour le RNA 16S, directement sous le promoteur pour le phage T7. Les délétions ont été produites dans pPM112 par mutagénèse dirigée à l'aide d'un oligonucleotide synthétique en utilisant le système du phage M13. Nous avons construit 2 plasmides mutés, pMAG10 et pMAG23, qui ont respectivement amputés des bases 896 …
